Méthodes de préparation des liposomes et synthèse des liposomes

 

 

Nous allons dorénavant étudier les différentes méthodes qui permettent de créer des liposomes. Les méthodes de préparation peuvent se regrouper en 4 groupes :

 

• Les méthodes de dispersion mécanique des phospholipides

• Les méthodes d’élimination du solvant organique

• Les méthodes d’élimination du détergent

• Les méthodes basées sur la transformation de liposomes préformés

 

 

Méthodes de dispersion mécanique des phospholipides

 

 

Ce groupe de méthodes comprend la méthode d’hydratation du film lipidique décrite par Bangham en 1965, qui permet d’obtenir des liposomes MLV et des méthodes de réduction de taille des MLV par traitement mécanique, c’est-à-dire l’extrusion, la sonication, la presse de French et la microfluidisation.

 

Hydratation du film lipidique

 

Cette méthode fut utilisée par Bangham en 1965, l’un des découvreurs des liposomes. Cette méthode permet surtout de réaliser des MLV qui pourront ensuite être réduits en liposomes SUV de taille plus petite. Cette méthode est l’une des plus utilisées pour la formation de ce type de liposome.

 

Cette méthode consiste à dissoudre tout d’abord les phospholipides dans un solvant organique ou un mélange de solvant organique comme le chloroforme : méthanol (2 : 1). Les phospholipides sont dissous dans des solvants organiques car ils sont hydrophobes et peuvent alors être solubles dans ces solvants. Le solvant organique est ensuite évaporé pour aboutir à la formation d’un film composé des phospholipides. Enfin, on place le film mince dans un milieu aqueux.

 

Dans ce milieu aqueux, le film lipidique s’hydrate et les phospholipides s’associent de manière à ne pas exposer leurs chaînes acyles au solvant : il en résulte la formation de bicouches, qui se referment en emprisonnant du solvant. Des bicouches peuvent enfermer d’autres bicouches de plus petite taille. Ainsi, lors de cette préparation, ce sont des liposomes MLV qui sont majoritairement produits.

 

C’est une méthode simple et rapide, et une grande variété de substances peut être incorporée. Le composé à encapsuler dans le liposome est ajouté selon sa solubilité, soit vis-à-vis de la phase aqueuse, soit vis-à-vis du mélange des phospholipides à dissoudre dans le solvant organique.

 

Néanmoins, les liposomes MLV présentent beaucoup d’inconvénients et ne sont pas utilisés dans la vectorisation de principes actifs. Des étapes sont alors nécessaires pour réduire ces liposomes MLV afin d’obtenir des liposomes SUV de taille convenable. Les étapes de la formation de ces liposomes par l’hydratation d’un film lipidique sont illustrées dans l’image suivante.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Représentation des différentes étapes de la préparation de liposomes MLV puis SUV par hydratation d’un film lipidique

 

Cette méthode de préparation doit s’effectuer à des températures supérieures aux températures de transition de phase Tm des phospholipides utilisés.

 

 

Sonication    

 

 

La sonication permet de diminuer la taille des liposomes MLV pour en faire des liposomes SUV. C’est la méthode la plus largement utilisée pour l’obtention des liposomes SUV dont la taille est comprise entre 20 et 50 nm. Afin de réduire la taille des MLV, ces derniers subissent des dislocations successives par l’envoi d’ultrasons sur ces liposomes, ces ultrasons viennent les disloquer. C’est une sonication, ils subissent cette sonication soit en utilisant un bain à ultrasons, soit une sonde à ultrasons.

 

 

Inconvénients de la sonication

 

La sonication présente plusieurs inconvénients car les liposomes formés ont un petit volume interne et l’encapsulation est donc plus faible. En outre, les liposomes peuvent être dégradés sous l’action des ultrasons et l’efficacité d’encapsulation des liposomes diminue lorsque la force de sonication est trop importante.

 

En effet, pendant la sonication, les phospholipides risquent de s’oxyder (au niveau des liaisons C=C) et même de s’hydrolyser (Klein, 1970 ; Hauser, 1971 ; Huang, Charlton, 1972). Pour éviter la dégradation, un certain nombre de précautions doivent être prises en soniquant à basse fréquence, durant un temps court et sous atmosphère d’azote ou d’argon (Lorin et al., en préparation).

 

L’encapsulation des liposomes formés est faible.

 

Dans le cas de la sonication par sonde à ultrasons, le milieu peut être contaminé par le métal de la sonde (titanium).

 

 

Presse de French (French pressure cell)

 

 

Les liposomes MLV sont placés dans une cellule de French dont la capacité est de 40 ml environ, et sont rapidement extrudés à l’aide d’un piston sous une très haute de pression à travers un petit orifice.

 

Une cellule de French est un « récipient » dans lequel un piston vient extraire rapidement la solution ou les composés par un petit « trou » de sortie. Cette méthode est aussi utilisée en biologie pour « casser » des cellules et en extraire divers composés.

 

Dans le cadre de nos liposomes, cette méthode nécessite des pressions bien plus élevées que celles utilisées avec les membranes de polycarbonate. Néanmoins c’est une méthode simple, rapide, et plutôt efficace. En effet, aucune dégradation de phospholipides n’est détectée après 10 passages consécutifs à travers la presse de French sous haute pression (20 000 psi). De plus, elle s’effectue en absence d’une atmosphère d’azote qui est nécessaire lors de la sonication.

 

Cependant, le principal inconvénient de cette méthode est la limite du volume de solutions de liposomes contraint à 50 ml. Cette méthode a notamment été bien détaillée par Hamilton, en 1980. 

 

 

Microfluidisation

 

La microfluidisation est encore une autre méthode pour réduire la taille des liposomes MLV et les homogénéiser. Le principe de la microfluidisation est le suivant. Une suspension de MLV est poussée à haute pression (10 000 psi) à travers un filtre possédant des pores de 5 µm de diamètre appelé microfluidiseur. La suspension se sépare ensuite en deux flux qui se rejoignent à grande vitesse pour former des vésicules de taille plus petites.

 

Lorsque les deux flux se rencontrent, les collisions des particules à grandes vitesses provoquent la dislocation et la reformation de liposomes de taille plus petite et SUV. La taille des liposomes diminue en augmentant le nombre de passages à travers le microfluidiseur et en augmentant la pression à l’entrée du circuit, donc la vélocité des flux de liposomes. Les liposomes obtenus après plusieurs passages ont un diamètre inférieur à 100 nm.

 

 

 

Les méthodes d’élimination du solvant organique

 

 

Les méthodes de préparation des liposomes SUV dites méthodes d’élimination solvant organique regroupent principalement les méthodes d’évaporation inverse.

 

Evaporation en phase inverse

 

Cette méthode concerne la préparation de liposomes SUV. Elle constitue un véritable progrès dans la préparation des liposomes puisqu’elle a permis l’obtention de liposomes SUV de grande cavité aqueuse. Les liposomes ainsi formés présentent alors un taux d’encapsulation très important.

 

L’évaporation en phase inverse réside dans la formation de micelles inverses après la sonication d’un mélange d’une phase aqueuse composée des molécules hydrophiles à encapsuler et d’une phase organique composée des phospholipides solubilisés. En effet, on solubilise tout d’abord les phospholipides dans une solution organique, puis on solubilise les molécules hydrophiles à encapsuler dans une solution aqueuse.

 

Le solvant organique le plus utilisé est l’isopropyl éther ou un mélange isopropyl éther/ chloroforme. On réalise ensuite la sonication d’un mélange de la phase aqueuse qui contient les molécules hydrophiles à encapsuler dans les liposomes et de la phase organique dans laquelle les phospholipides sont solubilisés.

 

L’action des ultrasons est de former une émulsion phase aqueuse/organique dans laquelle les phospholipides s’organisent sous forme de micelles inverses entourant des composants aqueux dont les molécules à encapsuler. Puis on procède à l’évaporation lente du solvant organique par évaporation sous pression induite, qui favorise le rapprochement des micelles inverses qui vont s’agréger et former un gel.

 

 

En effet, les micelles inverses composées de monocouches de phospholipides, entourant des compartiments aqueux, s’agrègent afin de former un réseau compact gélifié. L’évaporation totale du solvant organique comme l’éther est ensuite favorisée par la diminution de la pression, et entraine la rupture de la phase gel des bicouches de phospholipides. Les bicouches de phospholipides vont alors former des liposomes, comme on peut le voir sur le schéma suivant.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Représentation des différentes étapes de la formation de liposomes par évaporation inverse

 

Encapsulation

 

Cette méthode permet d’avoir des liposomes à un taux d’encapsulation maximale de 65% de la phase aqueuse (avec des solutions de faible force ionique), permettant alors d’encapsuler un grand choix de molécules hydrophiles. L’efficacité d’encapsulation est élevée pour ces liposomes puisqu’elle atteint, pour les molécules hydrophiles comme le sucrose, 65%, ce qui est un taux très élevé.

 

Inconvénients

 

Les inconvénients de cette technique réside dans le contact entre les molécules à encapsuler hydrophiles et le solvant organique, même pour une durée courte, car cette exposition peut endommager les brins d’ADN qui peuvent être encapsulés au sein des liposomes.

 

 

Les méthodes d’élimination d’un détergent

 

Les méthodes d’élimination d’un détergent consiste à solubiliser tout d’abord des phospholipides dans un milieu aqueux à l’aide d’un détergent comme le Triton X-100 (Levy ; 1990), l’ocytyl glucoside (Jiskoot ; 1986) et le cholate de sodium (Purwaningsih and Schubert ; 2004).

 

Détergents

 

De la même manière que les phospholipides sont amphiphiles, les détergents sont constitués de molécules amphiphiles d’origine synthétique, souvent issus du pétrole. On les appelle également des tensio-actifs et ces tensio-actifs, vont former des micelles tout en entourant des parties grasses comme de l’huile par exemple. C’est le principe du savon et des produits nettoyants. Lorsque les micelles se sont formées en « encapsulant » des produits gras, la tête des tensio-actifs étant hydrophile, ils sont ensuite évacués aisément par l’eau en emmenant la graisse avec eux.

 

Le Triton X-100 est l’un d’entre eux et sa formule brute est la suivante : C14H22O(C2H4O)n où n est égal à 9 ou 10. Sa formule topologique est représentée ci-dessous.

 

 

 

 

 

 

 

 

Formule topologique du Triton X-100

 

Le Triton X-100 est également utilisé en biologie cellulaire et moléculaire afin de rendre perméable les membranes plasmiques (cellule), nucléaires (noyau), etc. Ceci permet par exemple aux anticorps d'avoir accès au noyau de la cellule lors de la réalisation d'une immunocytochimie. Une immunocytochimie consiste à révéler et cibler des antigènes spécifiques grâce à des anticorps modifiés, à l’échelle cellulaire. Les antigènes sont les récepteurs à anticorps. On modifie et on utilise alors des anticorps possédant un fluorochrome, c’est-à-dire une molécule qui est fluorescente. On observe ensuite la cellule en question grâce à la fluorescence, la lumière qui est émise de l’anticorps possédant le fluorochrome.

 

Préparation des liposomes

 

Dans le cadre de la préparation de liposomes par élimination d’un détergent. On solubilise tout d’abord des phospholipides dans un milieu aqueux à l’aide d’un détergent comme le Triton X-100, l’ocytyl glucoside ou encore le cholate de sodium.

 

Ainsi les détergents et quelques phospholipides forment dans la solution, des micelles mixtes, c’est-à-dire composées des deux molécules amphiphiles.

 

Ensuite, on élimine progressivement le détergent utilisé et les micelles s’enrichissent progressivement en phospholipides. Les micelles enrichies de phospholipides viennent ensuite former des liposomes SUV de taille comprise entre 100 et 200 nm, et parfois même de taille inférieure à 100 nm. Les phospholipides forment des bicouches sphériques et donc des liposomes car leur paramètre d’empilement est compris entre ½ et 1, comme nous l’avons déjà vu.

 

La taille des liposomes formés par cette technique dépend de la nature chimique des phospholipides et du détergent utilisé, mais aussi de la concentration des phospholipides et du détergent.

 

Méthode d’élimination du détergent

 

Plusieurs méthodes d’élimination du détergent existent mais la dialyse fait partie des plus employées. La dialyse est une technique de purification de solution comme le sang en médecine. La dialyse consiste à séparer deux solutions à l’aide d’une membrane constituée de très fins pores de l’ordre du nanomètre, qui permet de ne laisser que le solvant passer, ou bien de laisser passer que le solvant et les solutés présentant une taille inférieure à celle des pores. Cette méthode est utilisée dans notre domaine pour éliminer le détergent.

 

Inconvénients

 

Cette technique présente des inconvénients puisque le processus peut laisser une petite quantité de détergents dans la solution, et il faut du temps pour nettoyer entièrement et finement le système de la dialyse. Le reste des détergents après le processus peut en effet être nuisible à de futures expériences avec ce même système.

 

La formation de liposomes par élimination de détergent est souvent longue et n’offre pas toujours des taux d’encapsulations élevés.

 

Encapsulation

 

Les taux d’encapsulation de ces méthodes peuvent atteindre au maximum 50%.

 

 

Méthodes basées sur la transformation de liposomes préformés

 

 

Hydratation par cycles de gel-dégel

 

Cette méthode permet de créer des liposomes LUV à partir de liposomes SUV. Elle consiste à exercer plusieurs cycles de congélation (azote liquide) et de décongélation (eau tiède) d’une solution liposomale. Cette méthode permet d’obtenir des liposomes LUV formés avec la fusion des liposomes SUV initiaux.

 

Encapsulation

 

Les LUV obtenus ont des taux d’encapsulation élevé d’environ 30%.

 

Cette méthode s’applique aussi à des liposomes MLV obtenus par la méthode d’hydratation d’un film lipidique, la méthode de Bangham expliquée plus haut. Pour de fortes concentrations en lipides de l’ordre de 400 mg/ml, on obtient des liposomes MLV avec des taux d’encapsulation pouvant atteindre 80%.

 

Lyophilisation-Réhydratation (Freeze-drying method)

 

Afin de former des liposomes, on peut également les stocker congelés puis les réhydrater. C’est la méthode de lyophilisation-réhydratation.

 

Lyophilisation

 

La lyophilisation est une méthode de conservation développée en 1906 à Paris. Cette méthode permet de stocker et préserver des produits en état de congélation. En effet, cette méthode consiste à ôter l’eau ou un autre solvant du produit en la/le sublimant du produit, c’est-à-dire que l’eau sorte du produit en passant directement de la phase solide à gazeuse (sublimation), sans passer par la phase liquide. Afin de sublimer l’eau contenue dans le produit, on glace le produit à de très faibles températures puis on le passe dans une chambre à très basse pression afin que l’eau contenue dans le produit passe à l’état gazeux. Cette technique permet de préserver le volume, l’aspect et les propriétés des produits lyophilisés.

 

De cette manière, on utilise cette méthode afin de stocker efficacement et durablement des liposomes préformés ou des solutions de lipides. Les lipides sont alors stockés sous forme de poudre lyophilisée qui sera hydratée par une phase aqueuse, ce qui permet d’obtenir des liposomes MLV avec un volume d’encapsulation important.

 

D’après des études menées en 1986 par Payne, cette méthode permet le stockage de « pro-liposomes » au sens où les liposomes sont déshydratés grâce à des particules de chlorure de sodium ou de sorbitol, avant d’être réhydratés. Cela permet de conserver les liposomes.

 

D’après Kirby et Gregoriadis, en 1984, on peut lyophiliser une solution de liposomes SUV puis la réhydrater, durant cette réhydratation, les bicouches des SUV fusionnent pour former des liposomes MLV avec un volume d’encapsulation important.

 

Cette technique est souvent employée pour encapsuler des molécules médicamenteuses dans des liposomes lorsqu’elles ne sont pas stables en phase aqueuse. Dans ce cadre-là, on lyophilise à la fois les liposomes et à la fois la molécule constituant le principe actif. Puis on les réhydrate ensemble.

 

Critères d’encapsulation

 

Les taux d’encapsulation souhaités doivent être étudiés en fonction de la méthode de préparation étudiée et de la taille des liposomes souhaités. Lorsque on veut encapsuler de grandes molécules (des macromolécules), le volume d’encapsulation doit être important. Dans le cas de liposomes destinés à délivrer des médicaments chez les patients, plus le taux d’encapsulation et le volume sont élevés, moins les volumes et les doses de liposomes à administrer aux patients seront conséquents. Enfin, la méthode de préparation ne doit pas dégrader les molécules à encapsuler comme peuvent les faire des solvants inadaptés.