Libération du Principe Actif

 

Après le ciblage des liposomes et leur acheminement dans les cellules cancéreuses, l’objectif est la libération plus ou moins contrôlée du principe actif dans ces cellules malades et non pas dans hors des zones malades. Les liposomes doivent donc être imperméables durant leur voyage sanguin, mais tout de même parvenir à libérer les principes actifs (PA) dans la zone souhaitée.

 

La libération des PA de manière contrôlée peut s’effectuer grâce à une multitude de stimuli comme la température, les ultrasons, la lumière, le pH et un champ magnétique.

 

Nous allons tout d’abord étudier les liposomes sensibles à une hausse de température (thermosensibles) et les mécanismes/sources d’augmentation de température. Ensuite nous étudierons les méthodes de relargage des PA des liposomes non thermosensibles, grâce aux ultrasons, la lumière, le pH et les actions d’hydrolyse.

 

 

Liposomes Thermosensibles

 

 

Une méthode de libération repose sur l’élaboration de liposomes sensibles à la température, appelés liposomes thermosensibles. L’objectif est de déstabiliser, c'est-à-dire de « fluidifier » la membrane du liposome afin de la rendre plus perméable, en fonction de la température.

 

 

 

Les Lipides utilisés pour la formation de liposomes thermosensibles (LTS et LTSL)

 

 

Les liposomes thermosensibles sont étudiés de telle manière à ce qu’ils aient un domaine de libération/perméabilité importante dans une gamme plus ou moins étroite de température. L’idéal est de créer des liposomes dont la perméabilité est très importante à leur Tm, ce qui est généralement le cas.

 

Comme nous l’avons déjà vu, de nombreux paramètres influencent la Tm d’une membrane liposomique comme la nature des phospholipides utilisés (nature des acides gras) et la présence de cholestérol (Chol).

 

L’objectif dans la création d’un liposome thermosensible est alors d’ajuster les différents composants des LTS ou LTSL afin d’obtenir des gammes de relargage sous températures intéressantes.

 

Les gammes de relargage intéressantes sont les températures peu élevées au-dessus de celle du corps humain afin que la Tm ne soit pas atteinte dans le corps humain et suffisamment faible pour ne pas être dommageable pour le corps humain. Il faut donc que Tm soit aux environs de 40°C. Les principaux phospholipides synthétiques sont classés ci-dessous en fonction de leur composition et leur Tm.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tableau illustrant la composition et la Tm des principaux phospholipides synthétiques

 

On peut voir que les  phospholipides intéressants dans la composition des LTS sont la Dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC) (Tm = 41.5°C) et la Dipalmitoyl phosphatidylglycérol (DPPG) (Tm = 41°C) car leur Tm est proche des 40°C, légèrement au-dessus de celle du corps.

 

Phosphatidylcholine

 

Les phospholipides souvent utilisés dans la conception des LTS sont les phosphatidylcholines. Voici un exemple de la formule topologique d'une phosphatidylcholine.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Formule topologique de la DPPC

 

La DPPC est le phospholipide idéal pour la conception des liposomes thermosensibles puisque :

 

 

• Une Tm de 41.5°C qui fait qu’une hausse de température (HT) modérée de 42° déclenche la transition de phase de la bicouche vers l’état fluide de forte perméabilité, entraînant ainsi le libération du PA (Principes Actifs).

 

Ajout d’autres phospholipides ou éléments

 

- Afin d’ajuster la Tm de la bicouche d’un liposome on peut ajouter des phospholipides ayant une Tm différente de la DPPC avec des concentrations plus ou moins importantes.

 

Par exemple, on peut ajouter un PEG à un DSPE:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Formule topologique du DSPE-PEG2000

 

Le DSPE-PEG2000 est souvent introduit dans la composition des LTS à une concentration précise pour obtenir la furtivité des liposomes en milieu sanguin.

 

Il augmente la perméabilité de la bicouche des TLS, diminuant ainsi la Tm de la bicouche dans son ensemble et augmentant le taux de libération du PA. Son influence varie en fonction de sa concentration dans la bicouche.

 

 

 

- Des lysolipides peuvent également participer à la composition des liposomes thermosensibles.

 

Les lysolipides ressemblent fortement à des phospholipides mais ils ne possèdent qu’un seul acide gras et sont de géométrie conique, comme on peut le voir dans la formule topologique de la molécule suivante.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Formule topologique de la MSPC

 

Les lysolipides induisent la formation de pores d’un diamètre proche de 10 nm au sein de la bicouche lipidique dont la perméabilité augmente de manière significative à la Tm. Ils permettent alors la libération très rapide du PA sous 42° C.

 

Leurs effets sur la Tm varient en fonction de leur concentration.

 

L’ajout de MSPC dans les bicouches des liposomes permet donc de favoriser la libération de leur PA. Les liposomes thermosensibles à lysolipides comme la MSPC sont dits à relargage ultrarapide et se surnomment LTSL. La libération ultrarapide est complète à 42°C en environ 5 minutes tandis que la durée de libération des LTS (sans MSPC) est plus lente, de plus de 30 minutes.

 

Le temps de passage des liposomes au niveau des tumeurs peut être court, alors une libération rapide est intéressante notamment dans le cadre de vectorisation par effet EPR par exemple.

 

La vitesse de libération du PA doit donc être inférieure à leur temps de transit en zones malades. 

 

 

Stimuli et hyperthermie

 

 

L’augmentation de température localisée au niveau du liposome peut être induite par différents stimuli comme les ultrasons, la lumière, les champs magnétiques, etc. Cette induction de chaleur permet d’atteindre la Tm de la bicouche du liposome et ainsi augmenter sa fluidité et sa perméabilité, et libérer les médicaments.

 

Ultrasons

 

Les ultrasons peuvent induire également une hyperthermie locale qui permet de déclencher la libération des médicaments et des principes actifs encapsulés dans les LTS. Lorsque les ultrasons se propagent dans un milieu, ils sont atténués en grande partie à cause de leur absorption par ce milieu. Lors de leur absorption, l’énergie mécanique des ultrasons (propagation dans le milieu) est convertie de manière très importante sous forme de chaleur. Plus la fréquence des ultrasons est élevée, plus l’absorption est importante et par conséquent, plus l’élévation de température est importante.

 

L’utilisation d’ultrasons focalisés permet de concentrer toute l’énergie en une seule zone spécifique comme les zones tumorales. Les ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU pour high intensity focused ultrasound) sont alors idéaux pour induire une hyperthermie localisée au niveau des cellules cancéreuses. L’augmentation de la température des cellules cancéreuses permet alors la libération des principes actifs des liposomes thermosensibles.

 

L’utilisation des ultrasons est intéressante puisqu’elle est globalement inoffensive pour le corps humain et sa pénétration dans le corps humain est aujourd’hui bien connue.

 

Lumière (PhotoThermie) 

 

La libération des principes actifs contenus dans les liposomes thermosensibles peut être permise par une augmentation de température provoquée par de la lumière. Les liposomes sont alors couplés à des nanoparticules sensibles à la lumière appelées photosensibilisateurs,  qui absorbent l’énergie des photons (quantas, corps de lumière) pour la convertir en énergie thermique. Cette augmentation de la température grâce au couplage à des matériaux sensibles à des longueurs d’onde spécifiques avec des liposomes, permet de libérer le médicament des liposomes thermosensibles couplés à ces systèmes. Cette méthode se nomme la PhotoThermie dont l'explication est la suivante.

 

Les matériaux conducteurs comme l’or et de nombreux métaux possèdent des électrons libres.

 

Les électrons libres sont des électrons qui ne sont plus liés à un atome, on dit qu’ils appartiennent à la bande de conduction. Ils peuvent évoluer et se déplacer au sein des métaux, ce qui est à l’origine de la conduction des matériaux conducteurs.

 

Un rayonnement électromagnétique peut exciter les électrons libres d’un corps et les faire entrer en oscillation. Les électrons libres oscillants se décrivent dans ce cas comme des plasmons de surface.

 

L’oscillation des plasmons de surface s’illustre comme une onde de densité d'électrons qui se propagent le long de surface du métal, à la manière (imagée) des vaguelettes qui parcourent la surface d'une mare lorsqu'on y jette un caillou.

 

Un plasmon est le quantum (quanta = plus petite quantité d’énergie quantifiée) d’oscillation de plasma, au même titre que les photons sont les quantas de la lumière, si ce n’est que les photons sont des particules alors que les plasmons ne sont pas des particules à part entière, mais seulement des quantas d’énergie résultant de la quantification de ces mouvements. Ils sont ainsi appelés « quasiparticules ».

 

Un rayonnement électromagnétique de longueur d’onde spécifique entraîne une oscillation des plasmons de surface, on dit qu’ils entrent en résonnance.

 

Dans le cadre d’une nanoparticule d’or, quand la fréquence de l’oscillation des plasmons de surface et la fréquence électromagnétique sont égales ou multiples (coefficient de proportionnalité entier), la nanoparticule d'or entre en résonance et vibre à de très fortes amplitudes.

 

Cette vibration libère de l'énergie thermique et produit alors de la chaleur. Cette production de chaleur se nomme alors « photothermie ».

 

Les nanoparticules d’or peuvent être greffées à la surface du liposome. La production de chaleur des nanoparticules en résonnance induite par un rayonnement électromagnétique conduit donc à augmenter la température du liposome thermosensible, conduisant ainsi à l’augmentation de sa perméabilité et à la libération de ces PA encapsulés.

 

Magnétisme

 

Les liposomes thermosensibles peuvent comporter des éléments ferromagnétiques.

 

Les matériaux ferromagnétiques sont des matériaux qui peuvent s’aimanter sous l’influence d’un champ magnétique extérieur et conserver cette aimantation après la disparation du champ magnétique extérieur. Les matériaux ferromagnétiques se distinguent en deux familles, les matériaux ferromagnétiques durs et les doux, en fonction de l'intensité des champs magnétiques nécessaire à leur aimantation.

 

Le magnétisme d’un matériau dépend également de sa température (température de Curie à laquelle le matériau perd son aimantation).

 

Les corps ferromagnétiques les plus courants sont le fer, le cobalt, le nickel mais aussi la magnétite.

On peut alors réaliser des aimants à partir des matériaux ferromagnétiques.

 

Un fluide composé d’éléments ferromagnétiques est appelé ferrofluide. Dans un ferrofluide, les particules ferromagnétiques sont sensibles à tout champ magnétique.

 

Lorsque ces particules magnétiques sont soumises à un champ magnétique, ces particules vont bouger. Ces mouvements provoquent des échanges de chaleur (énergie thermique).

 

Sous un champ magnétique alternatif, ces particules ferromagnétiques bougent davantage et génèrent beaucoup de chaleur. La production de chaleur dans des fluides comme le sang ou dans les cellules se nomme hyperthermie magnétique.

 

Des liposomes thermosensibles encapsulant des particules ferromagnétiques dans leur domaine aqueux ou dans leur bicouche peuvent être échauffés sous un champ magnétique externe de la même manière que les particules magnétiques dans les ferrofluides. L’augmentation de la température au sein du liposome induit une augmentation de sa fluidité membranaire et de sa perméabilité, conduisant à la libération des médicaments et principes actifs encapsulés. Ces liposomes sensibles à un champ magnétique externe se nomment également « magnétoliposomes ».

 

Guidage des magnétoliposomes

 

Un aimant présente deux pôles magnétiques, deux pôles magnétiques de natures différentes s’attirent tandis que deux pôles de même nature se repoussent. C’est le principe de base d’une boussole.

 

Comme les liposomes peuvent encapsuler des particules ferromagnétiques, ces liposomes peuvent alors aussi être attirés par des aimants. L’utilisation d’aimants pour diriger les liposomes et les déplacer se nomme le guidage magnétique.

 

Il est ainsi possible d’appliquer des forces magnétiques suffisamment importantes pour stopper les liposomes au sein des canaux sanguins et de les attirer vers des zones particulières. Grâce à ces magnétoliposomes, on peut donc placer un aimant puissant sur les régions cancéreuses afin de maximiser le taux de présence des liposomes dans les tumeurs concernées. De plus, les champs magnétiques sont inoffensifs pour le corps humain.

 

Les liposomes peuvent aussi libérer ces particules ferromagnétiques dans la cellule afin qu’elles génèrent de la chaleur sous l’influence d’un champ magnétique extérieur (hyperthermie magnétique).

 

Influence d’une hyperthermie sur les cellules et les tissus biologiques

 

L’augmentation de la température des cellules permet également de favoriser la pénétration des liposomes dans les cellules ciblées.

Tout d’abord, la température des tissus augmente, une des premières réactions physiologiques est une augmentation du flux sanguin, ce qui permet aux liposomes d’être plus rapidement acheminés dans les zones malades ciblées.

 

Deuxièmement, dans les canaux sanguins tumoraux (en proximité d’une tumeur comme pour l’effet EPR), des études ont révélé que l’augmentation de température des canaux sanguins en jonction avec des tumeurs, augmentait la taille des pores des micro-vaisseaux sanguins tumoraux uniquement (les pores formés dans l’endothélium vasculaire des vaisseaux sanguins = couche en contact avec le sang). L’augmentation de la taille de ces pores permet alors aux liposomes de pénétrer plus facilement dans les zones malades grâce à l’effet EPR.

 

Cependant, au-delà de 42°C d’élévation de la température au niveau des canaux sanguins des zones malades, les vaisseaux sanguins peuvent être endommagés et détériorés, voire même devenir hémorragiques.

 

 

Libération des liposomes non thermosensibles

 

 

La libération des principes actifs (PA) de liposomes non thermosensibles peut également se réaliser sous l’effet de stimuli comme la lumière, les ultrasons, le pH et les réactions d’hydrolyse qui peuvent avoir lieu au sein des cellules cancéreuses. Nous allons étudier tout d’abord la libération des médicaments encapsulés dans les liposomes via un stimulus lumineux.

 

Photo-isomérisation

 

Les liposomes peuvent également être composés de molécules amphiphiles synthétisées comportant des molécules dont les isoméries peuvent changer en fonction d’un rayon lumineux d’une certaine longueur d’onde. Cette sensibilité est appelée photo-isomérisation. La photo-isomérisation des doubles liaisons présentes dans les queues hydrophobes de molécules amphiphiles composées de ces éléments induit un changement d’isomérie et donc un changement géométrique qui peut induire une destabilisation de la bicouche et entraîner une fluidité membranaire plus importante ainsi qu’une perméabilité plus importante. La photo-isomérisation de ces molécules photosensibles induit donc la libération des PA par diffusion à travers la bicouche du liposome.

 

Les molécules dont la photo-isomérisation est possible sont généralement des dérivés azoïques. C’est-à-dire qu’il possède un groupe azo comme ceci :

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Formule topologique du groupe azo

 

Les molécules qui possèdent une liaison sont des dérivés azoïques comme l’azobenzène par exemple. L’azobenzène peut en effet se photo-isomériser comme on peut le voir ci-dessous.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Photo-isomérisation de l'Azobenzène

 

 

Par exemple, l’AzoTAB est une molécule amphiphile dont la queue hydrophobe contient un groupement azobenzène qui peut passer d’une isomérie E (trans) à une isomérie Z (cis) en fonction d’un rayon lumineux d’une longueur d’onde de 365 nm.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Photo-isomérisation de l’AzoTAB

 

Comme l’AzoTAB est une molécule amphiphile, elle peut être utilisée dans la composition de liposomes photosensibles. Lors de son passage à l’isomérie cis, elle entraîne une destabilisation de la bicouche (désordre) qui augmente la fluidité membranaire et augmente donc la perméabilité de la bicouche, libérant ainsi progressivement les médicaments et principes actifs encapsulés dans le liposome.

 

L’intérêt de la lumière est qu’elle n’est pas nocive lorsque ces longueurs d’ondes appartiennent au domaine visible inférieur à 700nm et au domaine infrarouge (supérieur à 800 nm), mais elle est très nocive lorsque les rayons sont des UV (Ultraviolets : Longueur d’onde inférieure à 350 nm).

 

Néanmoins  l’inconvénient majeur est la pénétration de la lumière visible inférieure à 700nm dans les tissus du corps humain qui est faible : elle est de l’ordre de 10mm pour des longueurs d’ondes du domaine visible.

 

Elle est cependant plus importante pour des longueurs d’ondes de 700 à 1000 nm puisqu’elle peut atteindre jusqu’à 10 cm. Il faut donc trouver des molécules photosensibles dont la photo-isomérisation s’effectue avec des longueurs d’onde comprise entre 700 et 1000 nm. Ce qui n’est, par exemple, pas le cas de l’AzoTAB décrit ci-dessus.

 

L’utilisation des photosensibilisateurs permet également de réaliser une thérapie très récente employant des liposomes qui est la thérapie photodynamique. Celle-ci permet également de tuer les cellules cancéreuses, en plus des principes actifs encapsulés dans les liposomes.

 

Thérapie photodynamique

 

La thérapie photodynamique repose sur l’utilisation de photosensibilisateurs. Lorsqu’ils sont excités par une certaine longueur d’onde, ils libèrent des espèces réactives de l’oxygène toxiques pour les cellules cancéreuses. Un photosensibilisateur est une molécule capable d’être excitée par des photons et de transférer son énergie à une autre molécule ou élément. Les espèces réactives de l’oxygène sont des molécules chimiques oxygénées tels que des radicaux libres comme la molécule de dioxygène dans un état particulier.

 

Les radicaux libres sont des atomes ou molécules qui ont gagné ou perdu un électron et qui de ce fait sont instables.

 

Par exemple, la molécule de dioxygène qui gagne un électron lors de la respiration cellulaire apparait ensuite instable, cette molécule n’aura alors de cesse de capter ou céder un électron à une autre molécule de son entourage, propageant le phénomène. Ces réactions en chaîne (stress oxydant) provoquent de nombreux dégâts dans les tissus, les organes et peuvent même modifier certains gènes. Ils sont par exemple, une des causes du vieillissement des tissus comme la peau (apparition rides).

 

Dans le cadre des tumeurs, la production de beaucoup de radicaux libres oxygénés (molécules de dioxygènes particulières) sont très toxiques dans les cellules cancéreuses, ils entraînent la mort de celles-ci. Ces radicaux libres oxygénés permettent alors de détruire les cellules cancéreuses et donc les tumeurs.

 

De plus, ils réagissent comme de puissants oxydants et dégradent les composants cellulaires en entraînant des modifications chimiques des molécules de cholestérol, nucléotides, phospholipides, etc… Ces radicaux libres oxygénés entraînent alors également la dégradation des liposomes et la libération de leurs PA. L’utilisation de ces photosensibilisateurs particuliers permet donc de libérer les médicaments encapsulés par le liposome.

 

L’ajout de photosensibilisateurs dans la composition et la conception des liposomes permet donc de libérer sous stimuli lumineux les molécules encapsulées dans le liposome comme les médicaments, et permet aussi de produire des radicaux libres oxygénés qui vont conduire à la mort de la cellule. Les liposomes ainsi employés sont alors deux fois plus efficaces que les liposomes ne disposant que des PA encapsulés. 

 

Délivrance des médicaments grâce aux ultrasons

 

Les liposomes (non thermosensibles) encapsulant des principes actifs peuvent aussi libérer ces PA sous l’action des ultrasons. En effet, les ultrasons peuvent déstabiliser fortement les liposomes par effet mécanique en exerçant des forces qui viennent « déformer » les bicouches des liposomes (forces de cisaillement). Cette déstabilisation a pour conséquence d’augmenter la perméabilité de la bicouche des liposomes, libérant ainsi les PA.

 

Couplage de magnétoliposomes et photosensibilisateurs

 

Un communiqué de presse du 24 mars 2015, du CNRS, révèle les dernières études et recherches en matière de liposomes. Les liposomes ont été combinés à des nanoparticules magnétiques et photosensibilisateurs activables par un champ magnétique et la lumière. Grâce à l’action cumulée des thérapies d’hyperthermie magnétique et de thérapie photodynamique, ces liposomes ont permis la régression totale d’une tumeur chez une souris.

 

Ces liposomes combinent alors photosensibilité et magnétisme.

 

Les chercheurs souhaitent ensuite exploiter les autres particularités magnétiques de ces magnétoliposomes en les déplaçant vers les tumeurs grâces à des aimants, et en les visionnant par IRM, s’assurant ainsi de leur bonne destination. On voit bien que les liposomes d’avenir reposeront sur le couplage de plusieurs propriétés comme le magnétisme et la photosensibilité.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Observation d’une tumeur intacte et d’une tumeur après la double thérapie des magnétoliposomes couplés à des photosensibilisateurs, d’après Riccardo Di Corato - laboratoire MSC (CNRS/Université Paris Diderot) : D’après la coloration Trichrome de Masson : Les noyaux des cellules sont bleus noirs, les cytoplasmes (corps cellulaires) violets, et les fibres de collagène (protéines sous forme de fibres conférer aux tissus une résistance mécanique à l’étirement) sont vertes.

 

Synthèse

 

Les liposomes peuvent encapsuler des médicaments et des principes actifs acheminés jusqu'aux cellules cancéreuses. Ainsi, la libération des principes actifs s'effectue par une multitude de stimuli comme la lumière, les champs magnétiques et les ultrasons. Ces liposomes sensibles aux stimuli se regroupent en deux familles, les liposomes dont la libération est assurée par une augmentation de la température (liposomes thermosensibles) et les liposomes non spécifiquement thermosensbiles. De plus, ces liposomes peuvent associer d'autres thérapies comme l'hyperthermie magnétique et la photothérapie dynamique qui induisent une diminution très importante ou totale des tumeurs.